多肽合成工艺概览

目前，固相合成法是多肽药物合成工艺的主流。在考虑技术应用、生产工艺、生产成本、质量管理和环保要求等方面，多肽药物的合成工艺主要分为化学合成法和生物合成法。

化学合成法主要通过氨基酸缩合反应来实现多肽的合成。这种方法包括固相合成法和液相合成法。固相合成法主要用于合成中长肽，它基于在固相支持上逐步添加氨基酸单元来构建多肽链。液相合成法主要用于合成短肽，其中氨基酸单元通过活化剂与其他氨基酸进行耦合反应。

生物合成法则包括酶解法、发酵法和基因工程法等。这些方法利用生物体内的细胞机制和酶的作用来合成多肽。酶解法通过酶的作用将原料多肽酶解成目标多肽。发酵法通过微生物的发酵过程来合成多肽。基因工程法则利用基因工程技术将编码目标多肽的基因导入到适当的表达系统中，使其在细胞内合成目标多肽。

目前，固相合成法相对成熟，并且已上市的多肽药物大多采用该工艺路线。这是因为固相合成法在多肽合成方面具有高度控制性、高产率和高纯度的优势。然而，随着生物合成技术的不断发展和完善，生物合成法在多肽药物的合成中也有着广阔的应用前景。

固相合成法是目前最常用的多肽合成工艺，经过多年的发展已相当成熟。在1963年，Merrifield提出了经典的固相多肽合成方法（SPPS），这一里程碑标志着多肽合成进入了一个新时代。在经过数十年的改进和完善后，固相合成法已形成了以Boc方法和Fmoc方法为主要体系的成熟工艺。

固相合成法的核心思想是将目标肽的第一个氨基酸的羧基与固相载体（通常是树脂）通过共价键结合在一起。然后，以该氨基酸的氨基为起点，通过去除氨基保护基和过量第二个氨基酸的羧基，进行酰化反应。这一步骤不断重复，最终得到目标肽。

不同的固相合成法主要区别在于所使用的氨基保护基。Boc方法以Boc作为氨基保护基，而侧链保护基通常为苄醇类化合物。Fmoc方法则以Fmoc作为氨基保护基。与Boc方法相比，Fmoc合成法具有酸性稳定、反应条件温和、副反应较少、产率较高等优势，因此在多肽固相合成领域得到广泛应用。

固相合成法的优势在于简化了每个步骤后续处理的工作，从而实现了自动化。它能够避免手工操作和物料转移中的损失。然而，固相合成法也存在一些缺陷，比如合成序列较短、耗时较长、产物纯度较低、成本较高以及试剂的毒性较大等。

固相多肽合成

Boc方法和Fmoc方法是固相合成法中常用的两种氨基保护基方法，它们在多肽合成中具有一些具体的区别，如下所示：

1、氨基保护基：

Boc方法（t-Butyloxycarbonyl）：Boc保护基是通过将t-Butanol酸与氨基酸的氨基反应而得到的，将氨基酸的氨基保护起来。这种保护基在碱性条件下稳定，在强酸性条件下可以被去除。

Fmoc方法（Fluorenylmethyloxycarbonyl）：Fmoc保护基是通过将氨基酸的氨基与Fmoc-Cl反应而得到的，同样是将氨基酸的氨基进行保护。Fmoc保护基在酸性条件下稳定，在碱性条件下可以被去除。

2、去保护方法：

Boc方法：Boc保护基在强酸性条件下可以被去除，常用的去保护试剂是酸，如三氟乙酸（TFA）。去除Boc保护基的过程需要使用有机溶剂，如二甲基甲酰胺（DMF）或二氯甲烷（DCM）。

Fmoc方法：Fmoc保护基在碱性条件下可以被去除，常用的去保护试剂是碱性溶液，如碱性丙酮（piperidine）溶液。去除Fmoc保护基的过程通常需要使用有机溶剂，如N,N-二甲基甲酰胺（DMF）或二氯甲烷（DCM）。

3、光敏性：

Boc方法：Boc保护基不具有光敏性，因此在Boc方法下可以使用紫外光进行光刻操作。

Fmoc方法：Fmoc保护基具有光敏性，暴露在紫外光下会发生光解反应，因此在Fmoc方法下需要在光敏化条件下进行保护和去保护操作。

4、反应条件：

Boc方法：Boc方法下的反应条件相对温和，适用于一般的氨基酸缩合反应。

Fmoc方法：Fmoc方法下的反应条件也较为温和，适用于一般的氨基酸缩合反应，但需要注意光敏性保护基的特性。

总体而言，Boc方法和Fmoc方法在氨基保护基和去保护方法上有所区别，选择使用哪种方法取决于具体的合成需求和条件。在实际应用中，Fmoc方法由于其酸性稳定、副反应少的优势，已成为多肽固相合成中较为常用的方法之一。

固相合成路线——以Fmoc合成法为例

液相合成法是一种广泛应用的多肽合成方法，具有明显的优缺点。

液相合成法可以细分为逐步合成法和分段合成法。逐步合成法通常从多肽的C端开始，逐个添加氨基酸，直至合成目标肽。这种方法一般适用于合成短肽或各种生物活性多肽片段。分段合成法是近年来发展较快的多肽合成方法，其化学专一性在长肽合成领域具有突出作用。分段合成法的核心思想是将目标肽合理地分为若干片段，在合成这些片段后进行连接缩合，最终得到目标肽。分段合成的主要连接方式包括天然化学连接、化学区域选择连接、可去除辅助基连接、光敏感辅助基连接、施陶丁格连接和正交化学连接等。

液相合成法具有许多优势，如高纯度、易于纯化和成本较低等。然而，它也具有一定的复杂性和繁琐性，需要耗费时间和精力。同时，由于分段合成技术的基础是天然化学连接，它必须依赖于半胱氨酸（Cys）残基，因此在应用中存在一定的局限性。

液相合成法是一种广泛应用的多肽合成方法，具有高纯度、易纯化和成本较低等优势。分段合成法作为其中的一种策略，在长肽合成领域发展迅速，通过合理分割目标肽并选择合适的连接方式，提高了合成的效率和专一性。然而，液相合成法也存在一些挑战，如复杂性高、操作繁琐、时间消耗较大，并且分段合成技术的应用受到半胱氨酸残基的限制。

液相合成基本原理

1、天然化学连接：
天然化学连接是指利用两个片段中天然氨基酸之间的化学反应来实现连接。最常见的天然化学连接方法是通过胺基（N-末端）和羧基（C-末端）之间的酰胺键形成连接。这种连接方式通过胺基与羧基之间的亲核取代反应，由胺基的氮原子攻击羧基的碳原子，生成酰胺键。天然化学连接方法在多肽合成中被广泛使用，因为它们可靠、高效，并且具有较好的兼容性。

2、化学区域选择连接：
化学区域选择连接是指在多肽的两个片段中，通过选择特定的化学反应，将两个片段中的非天然化学区域进行连接。这种连接方法不依赖于天然氨基酸之间的连接方式，而是利用片段中非天然化学团之间的特定反应发生连接。常见的化学区域选择连接方法包括使用特定的官能团、保护基和配体来实现连接。这种连接方法可以在特定的化学环境下发生，具有高度的选择性和专一性，因此在合成复杂多肽或含有非天然化学团的肽段时非常有用。

3、可去除辅助基连接：
可去除辅助基连接是一种通过引入可去除的辅助基来实现连接的方法。这些辅助基在连接完成后可以容易地去除，不留下任何痕迹。常用的可去除辅助基连接方法包括使用丙烯酸辅助基和酯辅助基。在连接完成后，通过适当的条件，如酸性或碱性条件，可以使辅助基发生裂解，从而得到目标肽。

4、光敏感辅助基连接：
光敏感辅助基连接是一种利用光敏化合物作为辅助基，在特定波长的光照下发生连接的方法。这种连接方法利用光敏化合物的光活性，通过光照来激活辅助基，使其与另一个片段发生连接。光敏感辅助基连接方法具有高度的空间和时间控制性，可以在特定的条件下实现连接，并且可以避免使用其他化学试剂。

5、施陶丁格连接：
施陶丁格连接是一种通过使用施陶丁格反应来实现连接的方法。施陶丁格反应是一种在两个官能团之间形成新的键的化学反应。在多肽合成中，施陶丁格连接可以用于连接两个片段中的非天然氨基酸残基。这种连接方法在多肽合成领域得到了广泛的应用。

6、正交化学连接：
正交化学连接是一种通过使用具有高度选择性的化学反应来实现连接的方法。这些反应在多肽合成中可以实现片段的无干扰连接，即在特定条件下只与目标片段发生连接，而不与其他官能团发生反应。这种连接方法的优势在于可以在复杂的化学环境中实现连接，避免副反应的发生。

液相分段合成常用方法

酶解法：一种通过使用生物酶将大分子蛋白质降解为活性多肽的方法。这种方法可以保持多肽的天然属性，保留蛋白质原有的营养价值，常用于食品、化妆品、饲料等行业。然而，由于酶解后得到的多肽分离困难，因此不适合用于合成特定的多肽序列。因此，在多肽合成领域，酶解法并不是常用的方法。

发酵法：一种通过微生物的代谢过程来获取天然多肽的方法。这种方法的生产成本较低，但应用范围较为有限。目前，能够通过发酵法独立合成的多肽主要包括ε-聚赖氨酸(ε-PL)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和蓝细菌肽等。

基因工程法：利用DNA重组技术，通过控制DNA模板来合成多肽。这种方法适用于长肽的制备。基因工程法具有表达定向性强、安全性高、成本低等优点。然而，它也存在一些缺点，例如开发周期长、分离困难、产率低以及不易进行规模化生产等。

酶解法主要应用于食品、化妆品、饲料等行业；发酵法适用于获取特定多肽，但应用范围较窄；基因工程法适合长肽的制备，具有一定的优点和缺点。在多肽合成领域，常用的方法是核糖体翻译和化学合成，这些方法能够实现对特定多肽序列的合成和定制。